Amy Acker a joué à partir de la saison 3 d'Angel la scientifique Fred et Illyria vers la fin de la saison 5. Après l'arrêt de la série en 2005, elle a joué dans le court-métrage Mr Dramatic où elle incarnait Jodi, dans les séries Supernatural dans l'épisode 3 Dead in the Water de la saison 1 où elle incarnait Andrea Barr, Alias dans la saison 5 pendant 13 épisodes où elle incarnait Kelly Peyton et a prêté sa voix pour le personnage   d'Huntress dans le dessin animé La ligue des justiciers pendant une saison. En 2006, elle a joué dans la série How I Met Your Mother avec pour partenaire Alyson Hannigan dans l'épisode Come On où elle incarnait Penelope et dans le film The Novice où elle incarnait Jill. En 2007, elle a joué dans les séries Drive où elle incarnait Kathryn Tully pendant 3 épisodes intitulés Rearview, No Turning Back et Partners, New York section criminelle dans l'épisode 3 de la saison 7 Smile où elle incarnait Leslie le Zard et Ghost Whisperer dans l'épisode 5 de la saison 3 Weight of WhatWas où elle incarnait Tessa. En 2008, elle a joué dans les séries Octobor Road dans 2 épisodes intitulés Hat? No Hat? et Dancing Days Are Here Again où elle incarnait Jenny Bristol et une fille en uniforme, Private Practice dans l'épisode 1 A Family Thing de la saison 2 où elle incarnait Molly Madison, dans les téléfilms Fire and Ice : les chroniques du dragon où elle incarnait Princesse Luisa et La Messagère où elle incarnait Ellie Daly. En 2009, elle a joué dans la série Dollhouse retrouvant Joss Whedon le créateur du show pendant 14 épisodes de toute la saison 1 et début de la saison 2 où elle incarnait le Dr Claire Sanders et Whiskey et dans le film 21 and a Wake-up où elle incarnait Caitlin Murphy. En 2010, elle a joué dans les séries Human Target dans l'épisode 12 Christopher Chance de la saison 1 où elle incarnait Katherine Walters, The Good Wife dans l'épisode 23 Running où elle incarnait Trish Arkin, Happy Town dans 8 épisodes où ele incarnait Rachel Conroy et Super Hero Family dans 2 épisodes No Ordinary Accident et No Ordinary Mobster de l'unique saison où aux côtés de Julie Webster son ex partenaire dans la série Angel elle incarnait Amanda Grayson. En 2011, elle a joué dans le film Sironia où elle incarnait Molly, dans la série Les Experts dans l'épisode 11 Man Up de la saison 11 où elle incarnait Sandy Colfax et dans le téléfilm Le plus beau des cadeaux où elle incarnait Crystal Carruthers. En 2012, elle a joué dans les séries Grimm dans l'épisode 11 Tarantella de la saison 1 où elle incarnait Lena Marcinko, Once Upon A Time dans l'épisode 14 Dreamy de la saison 1 où elle incarnait Astrid et Nova, Warehouse 13 dans l'épisode 9 The Ones You Love où elle incarnait Tracey la petite soeur de Myka Bering héroine principale du show, Person of Interest où elle est depuis régulière où elle incarne Root et Samantha Groves, les films La Cabane dans les bois où elle incarnait Wendy Lin et Beaucoup de bruit pour rien où elle incarnait Béatrice retrouvant ainsi Joss Whedon de nouveau et Alexis Denisof son ex partenaire dans la série Angel. En 2013, elle a joué de nouveau dans la série Les Experts dans l'épisode 19 de la saison 13 où elle incarnait Sandy Larken, dans la série Husbands dans l'épisode I Do Over où elle incarnait Claudia, a prêté sa voix au personnage de Nova dans la série d'animation Scooby-Doo : Mystères associés. En 2014, elle a joué dans la série Agents of S.H.I.E.L.D dans l'épisode 19 The Only Light in the Darkness de la saison 1 où elle incarnait Audrey Nathan. Prochainement nous pourrons la voir dans les films Let's Kill Ward's Wife où elle incarnera Geena, The Energy Specialist où elle incarnera Claire et dans le téléfilm The Write Man où elle incarnera Sophie.

Côté vie privée, elle est mariée depuis 2003 à l'acteur James Carpinello avec qui elle a deux enfants : Jackson né le 22 janvier 2005 et Ava née le 1er septembre 2006.