James marsters a joué Spike alias William le Sanguinaire pendant la saison 2, guest en saison 3 et régulier à partir de la seconde moitié de la saison 4 jusqu'à la saison 7. Après l'arrêt de Buffy, James Marsters a joué dans Angel en reprenant son rôle de Spike durant la 5ème saison. Depuis l'arrêt de la série, en 2004, il a joué dans la série La famille Carver dans l'épisode 8 A piece of the Rock de la saison 1 où il incarnait Ted Tunney. En 2005, il a joué dans le téléfilm Cool Money où il incarnait Bobby Comfort et dans la série Smallville pendant la saison 5 où il incarnait Brainiac un ennemi de Clark Kent venu de Krypton et sous les ordres du général Zod. Il avait désiré adapter McBeth au cinéma. En 2006, il a joué dans le film Shadow Puppets où il incarnait Jack. En 2007, il a prêté sa voix au personnage de Lex Luthor dans le jeu vidéo Superman Doomsday, a joué dans le film P.S I Love You où il incarnait John McCarthy, dans les séries Saving Grace dans l'épisode 2 Bring It On, Earl où incarnait Dudley Payne et FBI portés disparus pendant 4 épisodes où il incarnait le détective Grant Mars. En 2008, il a joué dans 3 épisodes Kiss Kiss, Bang Bang, Fragments et Exit Wounds de la saison 2 de Torchwood où il incarnait le Capitaine John Hart, dans le téléfilm The Capture of the Green River Killer où il incarnait Ted Bundy et a prêté sa voix au personnage du Capitaine Argyus dans l'épisode Cloak of the Darkness dans le dessin animé Star Wars : Clone Wars. En 2009, il a joué dans le film Dragon Ball Evolution tiré du manga Dragon Ball où il incarnait Piccolo, dans les séries Numb3rs dans l'épisode 15 Guilt Trip de la saison 5 où il incarnait Damian Lake, Lie to Me dans l'épisode 2 Truth or Consequences où il incarnait Jay Pollack, dans les téléfilms Mission Apollo 11, les premiers pas sur La Lune où il incarnait Buzz Aldrin, Invasion au Far-West (High Plain Invaders) où il incarnait Sam Danville et a prêté sa voix au personnage de Jimmy "Match" Morris dans le jeu vidéo Real Heroes : Firefighter. En 2010, il a joué dans 4 épisodes de la série Caprica où il incarnait Barnabas Greeley, dans 3 épisodes le pilote, Hana 'a'a Makehewa et Ha 'i' ole la saison 1 d'Hawaii 5.0 où il incarnait Victor Heese, dans la série Smallville de nouveau dans l'épisode Homecoming de la saison 8 où il incarnait Brainiac 5 et a prêté sa voix au personnage de Mr Fantastic dans le dessin animé The Super Hero Squad Show pendant une saison. En 2011, il a joué dans l'épisode 5 Shut Up, Dr Phil de la saison 7 de la série Supernatural où il incarnait Donald Stark, dans le téléfilm Huit Centimètres où il incarnait Troy Hamilton et a prêté sa voix au personnage de Lex Luthor dans le jeu vidéo DC Universe Online. En 2012, il a joué dans la série Metal Hurlant Chronicles dans l'épisode 2 Shelter Me où il incarnait Bran Davis. En 2013, il a joué dans les séries Wedding Band dans l'épisode 9 Personal Universe de la saison 1 où il incarnait Declan Horn, Warehouse 13 dans les épisodes The Living and the Dead, All the time in the World, The Truth Hurts de la saison 4 où il incarnait le Comte St Germain et le professeur Sutton revenant également dans le 1er épisode de la saison 5 retrouvant son ex partenaire Anthony Stewart Head de la série Buffy contre les vampires. a prêté sa voix pour divers personnages dans le dessin animé Scooby-Doo! Mystery Incorporated dans l'épisode Stand and Deliver et pour les personnages de Korvac et Chitauri dans le dessin animé Ultimate SpiderMan dans l'épisode Guardians of the Galaxy. En 2014, il a joué de nouveau dans la série Metal Hurlant Chronicles dans l'épisode Whiskey in the Jar de la saison 2 où il incarnait Doc Rowan. Prochainement, nous pourrons le voir dans le film Dragon Warriors où il incarnait Lord Tensley.

Parralèlement à sa carrière d'acteur, il fait de la musique étant chanteur dans le groupe Ghosts of Robots. Deux albums sont sortis en 2005 intitulés Civilizaded Man et en 2007 Like a Waterfall.

Côté vie privée, il s'était marié en 1989 avec Liane Davidson avec qui il a un fils Sullivan né en 1996. Le couple a divorcé en 1997. Depuis, il s'est remarié le 14 janvier 2011 avec Patricia Rahman à Los Angeles lors d'une cérémonie civile.